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亚硫酸氢转换的概述
亚硫酸氢转换开始时,有一些注意事项要记住确保最优性能和后续的准确性DNA甲基化分析。亚硫酸氢治疗本质上是一个残酷的过程,急剧变化的化学组成和物理性质的DNA。输入DNA转换从一个大,稳定,双链分子的集合随机分散,单链片段有彻底改变了几乎所有的胞核嘧啶尿嘧啶。这些变化极大的影响量化,质量评估,放大,bisulfite-converted DNA分析。这些点和特殊考虑他们需要对紫外分光光度法(NanoDrop),琼脂糖凝胶电泳,PCR下面突出显示。
Bisulfite-Converted DNA的量化
转换DNA应该量化RNA使用紫外分光光度计(NanoDrop) Ab260 1.0 nm = 40µg /毫升。在确定的复苏bisulfite-converted DNA,需要考虑两个主要因素1。)起始物料的完整无缺,2)。RNA污染。DNA的质量,大小,作为输入用于亚硫酸氢转换是最重要的因素在评估复苏。退化的原始材料将导致增加的样本亚硫酸氢转换过程。此外,RNA污染将大大加剧Ab260 nm导致DNA量的高估。RNA携带到转换丢失相比收益率出现低输入。重要的是,转换并不在上述情况下妥协。
评估Bisulfite-Converted DNA的质量
琼脂糖凝胶电泳凝胶(2%,100 bp标记)的转换DNA可以用来衡量经济复苏和碎片。通常不可见的凝胶时首先从凝胶中删除,这是正常的,结果被转换后几乎完全单链DNA。在冰浴冷却凝胶几分钟将迫使碱基对足以允许夹层溴化乙锭的DNA是可见的。转换后的DNA将涂片,一般从> 1500到100个基点。重要的是足够的物质被加载到凝胶允许可视化:通常大约100 ng /好就足够了。
Bisulfite-Converted DNA的挑战——DNA碎片和有限的碱基配对很难看到亚硫酸氢转换后的DNA。亚硫酸氢转换人类基因组DNA样本运行在2%琼脂糖凝胶100 bp标记可视化通常(左面板)和在冰浴冷却后面板(右)。
亚硫酸氢PCR引物设计
亚硫酸氢PCR技术是最常见的用于bisulfite-converted DNA甲基化分析,也最容易受到事故。记住DNA会大大分散,链不再是互补的,几乎完全缺乏胞嘧啶。亚硫酸氢PCR引物设计的关键是成功。亚硫酸氢与普通PCR、PCR引物需要长期(通常在基地26 - 30日)和扩增子的大小应该是相对较短的(150 - 300个基点)。理想情况下,引物不应该包含CpG网站,然而,如果他们是必要的定位在引物的5 '端胞嘧啶的混合基的位置。同样重要的是要注意,只有一个链bisulfite-converted模板将被放大任何底漆。只有反向引物会绑定到目标DNA,进而将生成模板为正向引物退火。通常,35至40成功放大所需周期。热态启动聚合酶也强烈建议非特异性扩增是相对常见的由于bisulfite-converted DNA at富集。退火温度之间则高达55 -°C通常工作得很好,和一个退火温度梯度与每一个新的引物组应该运行,确保最优的放大的具体目标。
亚硫酸氢退火对引物用于梯度PCR。亚硫酸氢复制pcr被孵化梯度热循环使用55到65 oc的退火温度梯度(左到右)。相等的数量从每个反应进行了分析在2%琼脂糖凝胶DNA标记100个基点。
引物设计甲基化特异性PCR (MSP)
甲基化特异性PCR (MSP)依靠放大来评估在特定CpG甲基化状态的网站。这个系统成功取决于模板的微分放大使用甲基化(M)和non-methylated (U)底漆集。虽然大多数考虑的亚硫酸氢的PCR引物设计是相同的,治疗CpG位点的引物是完全不同的。MSP需要定位CpG网站的3 '端引物与胞核嘧啶甲基化(M)引物和胸腺嘧啶non-methylated (U)引物。
亚硫酸氢PCR引物设计流程图和甲基化特异性PCR (MSP)。(A)重亚硫酸盐处理后,两个转换链的DNA模板不再是互补的。重要的是要注意,只有一个链会放大任意引物组,如下面的例子:亚硫酸氢(B)引物PCR用于后续的测序和分析扩增子内的胞核嘧啶。CpG位点引物中应避免或位于5 '端胞嘧啶的混合基的位置(Y = C / T, R = G / a)。测序数据通常是由一个“棒棒糖”阴谋,封闭的圆圈表示甲基化胞嘧啶位置和圆圈non-methylated的开放。(C)引物对甲基化特异性PCR (MSP)设计目标和评估特定CpG甲基化状态的网站。CpG位点引物内必须位于3 '端增加特异性甲基化(M)或non-methylated (U)模板。完全甲基化或non-methylated模板将生成一个单一的扩增子只从他们的代表MSP后引物组。与混合methythation样本,由底漆集将被放大。
酸性亚硫酸盐测序
重亚硫酸盐测序仍是最常用的技术分析bisulfite-converted DNA并提供解决整个扩增子单基地。与vector-specific克隆后测序引物建议获得最好的甲基化测序结果量化。亚硫酸氢PCR产物直接测序不推荐,因为它通常收益率测序质量差,会混淆量化部分甲基化的网站。焦磷酸测序可以作为替代直接测序。
亚硫酸氢下一代测序
下一代sequencing-based应用,如减少表示亚硫酸氢酸性亚硫酸盐测序(rrb)和全基因组测序(WGBS)越来越多地利用获得全基因组单基地决议甲基化分析和识别假定的生物标志物的候选人。在这两个工作流,转换效率就显得至关重要,即便是相对较小的效率的变化可以影响成千上万的个人网站。如果图书馆准备执行亚硫酸氢转换之前,重要的是,适配器添加到支离破碎的DNA甲基化来保护他们的序列。使用适当的控制dna也推荐样品如果non-CpG甲基化是一个因素(例如,在植物),占亚硫酸氢转换无法区分甲基化(5-mC)和hydroxymethylation (5-hmC)。
