rrb是什么?

有越来越多的挥动方法可用来配置DNA甲基化。减少表示酸性亚硫酸盐测序(rrb)是一种建立和有成本效益的方法,非常适合全基因组DNA甲基化分析。rrb利用限制消化丰富CpG密集的地区。MspI的限制酶在胞核嘧啶甲基化不敏感,削减CpG上下文(图1)。因此,通过与MspI消化样品,保证每个片段将包含至少两个CpG网站。因为DNA甲基化主要发生在CpG上下文,测序只有CpG富裕地区可以让研究者去捕捉大量的甲基化数据在降低成本。不像其他浓缩方法,rrb可以在单个碱基决议概要文件样本,成为一个优秀的飞行员甲基化研究的技术。

rrb库特征

大多数图书馆准备协议需要分裂的输入来实现适当的插入大小。因此,一个成功的图书馆将有一个片段剖面与峰值(s)对应于预期的插入。rrb, MspI同时丰富了CpG密集的地区和DNA碎片,导致短库相比其他RNA-seq等公共库。因为MspI识别一个特定的网站(图1),由此产生的图书馆将有一组模式由减少站点的分布在个别物种的基因组。在人类样本,MspI消化会导致高峰在69年,134年和205年英国石油(bp)所描述的官方发展援助等。^[1]MspI消化后,峰值对应片段的长度加上全身Illumina公司TruSeq适配器的长度。

如何序列rrb库

图书馆浓度和量化

作为图书馆的所有准备工作,量化qPCR-based方法如KAPA Illumina公司量化,或类似的,确保准确加载浓度是至关重要的。因为rrb库是由一系列片段大小,其中一些可以相对较小,尺寸调整计算KAPA量化后是必要的。较大的碎片将会产生更强的荧光信号相比,短片段相同的浓度,因此,如果片段长还是短的DNA的标准,必须进行尺寸调整。此外,应谨慎地对PhiX执行KAPA量化标准仅收到后确认使用适当数量的激增。

PhiX激增

rrb库测序需要特别注意事项:由于CpG亚硫酸氢浓缩和转换,rrb库丰富,因此低复杂性,除了每个库的开头插入一组模式由于MspI消化。常用的PhiX激增控制不仅可以监测关键指标的,也介绍图书馆多样性,例如rrb。rrb库最优数量的PhiX激增将取决于测序池的内容以及具体的Illumina公司测序平台。以下是建议使用NovaSeq PhiX起点。进一步优化PhiX激增可能有必要基于百分比的排序指标首次运行。

准备最后的图书馆

一旦量化库和激增,他们应该被稀释和变性Illumina公司提供的系统特定的指南。准备在一个简单的方法是首先稀释库池和PhiX相同的浓度,然后结合相应的卷达到预期的比例激增。例如,实现10% PhiX激增加载浓度为1.6点的总量1300µL图书馆和PhiX控制相结合,稀释图书馆池和PhiX到1.6点,分别,然后结合1170µL图书馆与130µL PhiX池。由于小尺寸rrb库与其他库类型相比,加载浓度低于推荐值Illumina公司可能是必要的,以避免over-clustering的标准指南。

结论

rrb是划算的,全基因组DNA甲基化分析技术。为达到最佳效果,应该特别注意图书馆量化和激增的参数。

09年6月,2022年